Marie Marguerite Du Frost de Lajemmerais, Veuve d'Youville, a été béatifiée à Rome le 3 mai 1959. Suite à cet événement, Mgr Gérard-Marie Coderre, évêque du diocèse de Saint-Jean-de-Québec (aujourd’hui Saint-Jean-Longueuil) promeut la construction d’un sanctuaire à Varennes, sur les lieux mêmes de la naissance de la première bienheureuse née au Canada. L’inauguration officielle se fait le 25 juin 1961 par une messe solennelle « précédée d’un défilé de chars allégoriques représentant les diverses phases de la vie de Marguerite d’Youville ».
Ce sanctuaire est avant tout un lieu de culte pour honorer Mère d’Youville et faire connaître sa spiritualité : confiance en Dieu Père et compassion envers les plus démunis. Il accueille les pèlerins qui viennent en visite privée, en groupe ou en pèlerinages diocésains. La fête liturgique de Mère d’Youville est le 16 octobre.
En octobre 1971, l'évêque du diocèse confie l'administration du Sanctuaire aux Soeurs Grises de Montréal, communauté fondée par sainte Marguerite d'Youville. Voici les noms des directrices qui se succéderont: sr Emma Henri (1961-1980) sr Blandine Lévesque (1980-1989) madame Gabrielle Gagné (1989-1993) sr Gabrielle Morin (1993-1999) et sr Simone Ouellet (2000-2002).
Le 26 octobre 1975 a eu lieu à Cana en Israël le jumelage entre le Sanctuaire de Mère d'Youville de Varennes et le Sanctuaire du Premier Miracle de Jésus à Cana. Sr Emma Henri participe à cette célébration, accompagnée de 22 personnes. On lit une lettre de voeux venant du Père Maurice Lafond c.s.c. curé de la paroisse de Varennes. En 1980, un vitrail réalisé par M. Claude Bettinger est installé dans l'église de Kafar-Cana pour commémorer le jumelage.
En 2003, le Sanctuaire est rétrocédé au diocèse de Saint-Jean-Longueuil qui nomme les membres d’un conseil d'administration dont la mission est de gérer les activités du Sanctuaire. En 2010, suite à l'annonce du retour des restes mortels de sainte Marguerite d'Youville à Varennes, l'édifice du sanctuaire est transformé en un lieu d'exposition sur la vie et l’œuvre de sainte Marguerite.
Depuis le 9 décembre 2010, le Sanctuaire de sainte Marguerite d'Youville est un site comprenant une exposition permanente, une chapelle funéraire dans la Basilique Sainte-Anne de Varennes où a été déposé le tombeau de sainte Marguerite d'Youville, ainsi que « la Maison Grise » lieu d’accueil pour le repos des pèlerins et l’entraide communautaire.